双抗夹心ELISA试剂盒的反应时间

   在保证 ELISA 有效检测病原菌的前提下，快速方便也是双抗夹心ELISA的必要条件。双抗夹心ELISA从加入待测抗原到得出结果，检测大肠杆菌 O157:H7 共需要5h左右，而间接ELISA则需要7h(包被 37℃，2h)或 者 17h(包被 4℃guo夜)。本论文筛选出的双抗夹心ELISA检测大肠杆菌 O157:H7 省去封闭这一步骤。在间接ELISA测定抗原中，封闭一般是*的，因为包被不同浓度抗原不一定可以*覆盖固相载体表面，如果不封闭，很可能使随后加入的特异性抗体和酶标二抗直接被吸附到固相载体上，产生非特异性显色而使检测结果偏高。但是对于双抗体夹心ELISA来说，在包被捕获抗体时已经使固相载体饱和，已经没有多余的吸附力来吸附随后加入的特异性抗体和酶标二抗，这都说明 了双抗夹心ELISA有不需要封闭的可能，通过正交试验结果也证明不封闭可以达到理想实验效果，而且还缩短了整个检测流程和时间，说明只要酶标记物是高活性的 并且操作时洗涤*，不经封闭也可得到满意结果。双抗夹心ELISA检测法的特异性和灵敏性抗原抗体的结合实际上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间，由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特 异性。但这种特异性并不是的，假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可能出现交叉 反应。本实验以大肠杆菌 O157:H7 及其他菌株共 10 株作 为抗原用来检测本方法的特异性，结果显示大肠杆菌 O157:H7 呈明显阳性反应，其余各菌株均呈阴性反应， 说明本方法对大肠杆菌 O157:H7 具有明显的检测特异 性，而对所测定的其它菌株无交叉反应。

   本论文所建立的双抗夹心ELISA方法对纯培养的 大肠杆菌O157:H7检出限均105CFU/ml，Kerr 和 Chart 等[6]建立的双抗夹心 ELISA 检测大肠杆菌 O157:H7 的检测限为 10 5 CFU/ml ，建立的双抗夹心ELISA 检测大肠杆菌 O157:H7的检测限为 104CFU/ml，两者均用单克隆抗体作为检测抗体，而本方法使用IgY 抗体与兔多克隆抗体，制备相对比单克隆抗体简单，对试剂成本要求也相对降低，其效果基本达到检测要求。