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    研域详述:原代细胞复苏和传代流程

    发布时间: 2019-08-13  点击次数: 50次

    一、实验前准备工作:
     
    1、培育瓶的包被:包被液如多聚赖氨酸或纤维粘连蛋白,以无菌水稀释至2 ug/cm2的浓度包被培育瓶。37度孵箱1小时或4度过夜,从包被好的培育瓶中收回多聚赖氨酸,并用无菌水洗刷培育瓶2遍。包被好的培育瓶不要放置超过24小时,其中的包被液可吸出重复使用2-3次,留意不要污染。


    2、彻底培育基的配置:以内皮细胞培育基为例,把配套的胎牛血清、生长因子和双抗参加根底培育液中。重新贴好标签,并混匀培育基。

    二、原代细胞复苏办法:

    1、从液氮中取出原代细胞冷冻管,迅速投入37~38 ℃水浴中,其间能够悄悄滚动细胞,加速消融速度,大约需求1分钟时刻。

    2、5分钟内用培育基稀释至原体积的10倍以上,参加培育瓶中,再用1ml培育基洗刷细胞冻存管,确保细胞都被参加培育瓶中,静置于孵箱,12-16小时后替换培育基(除去DMSO)。今后每2天换一次液,确保细胞状况杰出。

    三、原代细胞传dai办法:酶消化法

    当细胞生长至70-80%左右能够传代,传代份额以1:2或1:3为佳。具体办法如下:

    1、弃去培育瓶中培育基,用PBS洗刷培育瓶2遍,参加0.25%的胰酶消化液,以消化液能覆盖整个瓶底为准。37度孵育4分钟左右,轻拍培育瓶旁边面,显微镜下观察细胞消化状况,直到80%细胞呈现圆形。

    2、细胞消化好后,参加胰酶中和液,并悄悄摇摆培育瓶,形成细胞悬液,然后将细胞和培育基转移至离心管中,1000rpm离心5分钟。
     
    3、弃去上清液,以1-2ml新鲜培育基重新悬浮细胞并吹打均匀,接种于包被好的新培育瓶中,瓶中已有10ml左右的培育基,放入培育箱中培育,每2天替换培育基。

     

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