用噬菌体上清和人血清进行ELISA

用噬菌体上清和人血清进行ELISA[
器材和试剂]
● 多孔板 （Immuno plate Maxisorp， Nuric）
● 包被缓冲液 （50mmol/L NaHC03， pH 9．6，0．05％硫柳汞）
● 单克隆抗体（mAb）57D1。该抗体 能识别M13噬菌体次要衣壳蛋白（pⅢ）的N末端。它是用M13噬菌体 颗粒免疫大鼠而获得的。来自含57D1 杂交瘤细胞的上清用 50％ （NH4）2SO4沉淀，然后在PBS中溶 解并透析，zui后抗体在蛋白G—Sepha— rose上免疫纯化。
● PBST
● 封闭液（PBS，5％脱脂牛奶，0．05％ Tween—20，0．02％硫柳汞）
● 噬菌体上清
● 细菌提取物
● PEG—浓缩的nRl—11．1噬菌体
● 来自无关的大鼠杂交瘤细胞上清
● AP标记的羊抗人IgG Fc—特异性抗体 （Sigma），用封闭液按1：5000比例稀释
● 底物缓冲液（10％二乙醇胺，0．5mmol/ LMgCl2，0．05％NaN3，用HCl调节到 pH 9．8）
● 显色液（1mg/ml p—硝基苯磷酸的底物 缓冲液）
● 自动酶标仪

[方法]
1．将200ul浓度为1ug/ml的抗pⅢmAb 57D1①包被缓冲液，分别加在多孔板各个板孔 中。4℃孵育过夜。
2．弃去包被液，并用PBST洗涤数次。
3．每孔加250ul封闭液，37℃孵育60分钟。包被板可立即使用或在一20℃保存数周。
4．每孔加100ul封闭液和100ul如上述制备的清亮噬菌体上清。在37℃下孵育60分钟以 使噬菌体颗粒结合。
5．将人血清在200ul封闭液中，室温预孵育30分钟；其中包含2．5ul细菌提取物、大约 5 × 1010pfuPEG—浓缩f1Rl—11．1噬菌体以及10ul来自无关大鼠杂交瘤细胞上清。当 检测单个克隆时，采用1：100比例稀释血清； 当检测噬菌体文库时，采用1：400比 例稀释血清。此步可以减少针对野生型噬菌体的血清抗体、细菌污染物及大鼠抗pⅢ单 抗的干扰。
6．从包被板中弃去噬茵体上清，并用PBST充分洗涤板孔。
7．在每孔中加200ul预孵育的血清混合物，在室温下孵育2小时。
8．除去血清混合物，用PBST充分洗涤板孔。在每孔中加入200ul碱性磷酸酶标记二抗， 室温孵育60分钟。
9．除去二抗溶液，并用PBST充分洗涤。用底物缓冲液快速洗涤板孔。
10．在每孔中加200ul显色液，37℃暗处孵育15—60分钟。
11．用自动酶标仪将A405和A655间的差值作为结果记录。