细胞生物活性的化学检测法

细胞生物活性的化学检测法
一、四唑盐(MTT)比色法：
检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外，还可用四唑盐比色法试验(MTT)。此法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1 x10^9个/L的但细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100ul。
●将培养板置CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下，培养3-5天。
●培养3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，继续置培养箱孵育3-6h，终止培养，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培养数小时，将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解。
●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度(OD)，选波长490nm。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。
用此法测细胞活力，为保证结果的准确性，在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不会过满。另外，实验时设空白对照，比色时，以空白孔调零。
二、细胞蛋白质含量测定法(考马斯亮蓝测定法)：
基本原理为：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合，在595nm波长处呈zui大吸收，其OD值与蛋白质含量成正比。主要用于测定妹、受体及细胞外代谢物的特异性活性。
●用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成悬液，用含10%胎牛血清的RPMI培养基调整细胞浓度为1×104个/ml，接种24孔培养板，每孔1ml，置37℃、5%CO2条件下培养一段时间。
●用胰蛋白酶消化分散，培养板的细胞悬浮在PBS中，细胞计数，取106细胞以1000r/min离心5min，弃上清，加0.5 ml 0.1%SDS或0.3mol/LNaOH，置100℃煮3min，使细胞裂解。
●取0.1考马斯亮蓝染液与100ul上述细胞裂解液混匀，放置10min。
●用可见光分光光度计在595nm波长处测定溶液的OD值。以溶剂为空白对照，以已知量的牛血清蛋白为标准品，绘制标准曲线。然后根据曲线推算样品中蛋白质含量。
三、细胞蛋白质合成测定法(3H-亮氨酸掺入法)：
基本原理为：细胞在合成蛋白质时需要摄取外源性氨基酸，用同位素标记氨基酸如3H-亮氨酸可以掺入细胞蛋白合成代谢中，通过测定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢情况。
●取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，悬浮于含10%胎牛血清的RPMI培养基中，调整细胞密度107-109个/L，接种于24孔培养板，每孔1ml。
●将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞处于对数生长期时，每孔100ul预温37℃的3H-亮氨酸。
●继续培养4-24h。
●终止培养，取出培养板，小心吸取培养上清，用预冷的PBS洗涤，晾干。如果细胞松散，可先用甲醇固定10min。
●把培养板放在冰盖上，每孔加1ml 10%三氯醋酸(TCA)，在4℃放置10min，吸取上清。
●甲醇洗涤、晾干。
●每孔加0.5ml 10.3 mol/L NaOH，1%SDS，室温下放置30min。
●混匀，移入闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(cpm)，以cpm/106细胞或cpm/mg蛋白表示。
对悬浮生长的细胞则采用离心法处理。
四、细胞DNA合成测定法：
1、3H-TdR掺入法
基本原理为：胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA*的碱基，也是DNA合成的必需物质。用同位素3H标记即3H-TdR作为DNA合成的前体掺入DNA合成代谢过程中，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。
(一)方法一
●取对数生长期细胞，制成3 X 10^8个/L的细胞悬液，接种于24孔培养板中，每孔1ml。
●将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中培养24h左右。
●在细胞处于对数生长期时，每孔加入100ul3H-TdR(用HBSS)配制，3.7 X 10^8 Bp/L过滤除菌，使终浓度为3.7 X 10^7 Bp/L。
●继续培养1-24h。
●终止培养，小心吸弃上清，用HBSS漂洗单层细胞2次，然后加入2mo预冷的10%TCA，放置10min。如果细胞松散，应先用固定甲醇10min，用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数，结果以cpm/10^6细胞表示。
(二)方法二
●同方法一*步。
●将培养板放入37℃、5%CO2培养箱中培养56h左右。
●每孔加入100ul 3H-TdR。
●继续培养16h。
●终止培养，将细胞收集于49型滤膜上，如为贴壁细胞，吸弃培养上清后，用0.25%胰蛋白酶消化2-5min；如为血细胞，先用蒸馏水破红细胞。然后再收集细胞，收集后要加10%CTA和甲醇固定。
●将滤膜烘干后移入已知有3min闪烁液的闪烁瓶中，在液体闪烁计数仪上测定每分钟脉冲数或衰变数，结果以cpm/10^6细胞或dpm/10^6细胞表示。
2、流式细胞仪测定DNA合成
用流式细胞仪测定细胞增殖周期和DNA合成是20世纪90年代发展起来的新手段，不仅快速、准确、效果好，而且消除了同位素标记的许多繁琐方法和放射性污染。
●取80%汇合至接近*汇合的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，制备成单细胞悬液，细胞密度1想0^9个/L，注意不要留有细胞碎片。
进行流式细胞仪检测。除检测细胞周期时相变化和反应DNA合成外，还可了解染色体倍性；结合荧光免疫法，还可对细胞膜进行分析等。

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