人—山羊异质胚胎构建及胚胎干细胞的分离培养

人胚胎干细胞（hESCs）有分化为机体各种细胞的潜能,是再生医学、药物筛选及发育研究的一个重要来源。hESCs是从人胚胎细胞分离培养而来的,然而,人胚胎来源不足严重限制了hESCs的研究。以动物卵母细胞为受体、人体细胞为供体细胞的异质核移植技术为hESCs的研究提供了新的途径,本文尝试了用山羊卵母细胞为受体、人包皮成纤维细胞（HFFs）为供体构建人-山羊异质核移植（human-goat interspecies nuclear transfer, hgiNT）胚胎,并分离hESCs,旨在优化hgiNT方案,并为建立hESCs系提供技术帮助。研究内容如下: 1.为了选择遗传均一的供体细胞用于核移植,本实验分别用条件培养液或用饲养层共培养对HFFs进行克隆分离和扩大培养,对照组在无饲养层的新鲜培养液中培养,Giemsa染色分析克隆细胞核型。结果:共培养组克隆存活率（31.43 %）显著高于对照组（5.56 %）（P<0.05）,与条件培养液组相近（27.27 %,P>0.05）;饲养层共培养组扩大培养率（11.43 %）显著高于对照组（0 %）（P<0.05）。7个细胞克隆中5个表现为正常核型（2n=44+XY）。结果表明,两种方法均能提高HFFs形成克隆的比例,且能保持细胞染色体核型正常,用于核移植前供体细胞的筛选。 2.为了探索hgiNT条件,本实验首先对电融合参数进行了摸索,进而测试了融合与激活间隔时间对重组胚胎体外发育的影响,zui后对比了mSOFaa和G1/G2序贯培养法对重组胚胎体外发育的影响。结果*的融合电压、脉冲时程和脉冲次数分别为36 V、20μs和2次,*的融合与激活间隔时间为4 h,G1/G2序贯培养法的卵裂率和囊胚率均显著高于mSOFaa培养法（71.81 % vs. 64.78 %,9.73 % vs. 4.76 %;P<0.05）。结果表明:hgiNT的电融合参数及融合与激活间隔时间与受体卵母细胞供应方（山羊）体细胞核移植相似,而核移植胚胎的培养条件倾向于供体细胞供应方（人）的胚胎培养条件。 3.本研究探讨了TSA对供体细胞或重构胚处理对hgiNT胚胎发育的影响。选择经5、25、50、75、100 nM TSA处理24 h的山羊胎儿成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,结果在50、75 nM组,囊胚率有所增高（9.91 %、12.10 % vs. 8.47 %,P>0.05）;用5,25,50,75或100 nM TSA处理重构胚10 h,结果5、25、50、75 nM组的囊胚率均有所提高,其中25 nM组显著高于对照组（16.41 % vs. 7.63 %,P<0.05）。TSA处理供体细胞和重构胚均能显著提高克隆胚囊率,说明低甲基化的供体细胞有利于卵母细胞的重编程,推测TSA可能降低了核移植后供体细胞组蛋白去乙酰化水平,因而提高了克隆胚的发育率。 4.本实验（1）用10 mg/L的丝裂霉素-C分别处理HFFs、MEFCs和GEFCs饲养层1.5 h、2 h、2.5 h、3 h,冷冻-复苏后培养12 h,统计复苏率,选择合适的处理时间;（2）用HFFs、MEFCs和GEFCs作饲养层,接种ICM,比较它们对hESCs的支持情况;（3）在不同密度的HFFs饲养层上,接种相同的ICM数,统计hESCs的贴壁率、克隆形成率、分化率,从中选择合适的饲养层密度。结果显示:（1）以10 mg/L丝裂霉素-C*处理时间为2 h;（2）HFFs和MEFCs饲养层均能有效地支持hESCs增殖和保持未分化状态;（3）HFFs饲养层的*密度是3×104/mL。 五、为了克服培养体系中异源性成份污染hESCs临床应用的限制,本实验采用无动物源性成份确定的HESCO体系对hgiNT胚胎来源的hESCs（iNT-hESCs）进行体外培养（HESCO组）,以HFFs为饲养层的常规培养体系为对照组（HFF组）,观察iNT-hESCs在两种培养体系中的生长状况,探讨HESCO体系对iNT-hESCs生长的支持情况。结果,HESCO组的iNT-hESCs有与HFF组相似的细胞形态、增殖速度、碱性磷酸酶活性和遗传稳定性;结果表明HESCO培养体系能支持iNT-hESCs的生长并能保持其未分化状态,这对iNT-hESCs用于临床治疗且有重要意义。