免疫组化中常用的组织和细胞标本管理方法

    分析免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。常用的免疫组化组织和细胞样本该怎么管理？
 (一) 石蜡切片
石蜡切片是制作组织标本zui常用、zui基本的方法 。
zui大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察； 
石蜡块还能长期存档，供回顾研究。 
石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改
善，因而它是大多数免疫组化中的组织标本制作方法。 
1.取材的特殊要求及注意事项 
*标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原
或变性消失，或严重弥散。 
*取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。 
*-细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。 
2.取材的特殊要求及注意事项(续) 
*避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因
而取材时应使用锋利的刀刃，镊取组织动作要轻；经窥镜直接钳取的组织往往有
过度挤压，观察结果时应有所考虑。 
3.固定及常用的固定液 
*取材后的组织需立刻投于固定剂中 
固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。 
*常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。 
-醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛） 
-醇类（常用乙醇） 
-其它 （丙酮） 
(1) 醛类 
*甲醛(福尔马林)应用zui广 
-原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。 
-优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。 
-缺点： 
*甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 
*醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍； 
*分子间交联形成的网格结构可能部分或*掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 
-注意事项： 
C)，为此组织块不宜过厚。?*缩短固定时间，降低固定温度(4 
*改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10％甲醛固定液，减少固定液pH的变化。 
*固定后充分水洗以减少分子间交联。 
*切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。

*戊二醛： 
-穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。 
*多聚甲醛(常用4%)： 
-可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。 
*主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。 
(2) 醇类 
* zui常用的醇类固定剂是乙醇。 
-其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。 
-优点：穿透性强、抗原性保存好。 
-缺点： 
*脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。 
*乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。 
(3) 其它固定剂 
*丙酮： 
-对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。
 
(二) 冰冻切片
*冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接切片。 
*在切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程。 
-缩短了制片时间 
-抗原性不受损失 
*对稳定性差的抗原，如淋巴细胞表面抗原尤其适合。 
*组织冻结过程中，细胞内、外的水分会形成冰晶，冻结的速度愈慢，冰晶颗粒愈大，可严重影响组织、细胞的形态结构。因此制备冻块时要求低温、速冻。 
1、冰冻组织块的常用方法 
*液氮中冰冻：组织投入液氮中 (-196?C)10-20sec。
*干冰中加入丙酮(或异戊烷)，液体立即气化起泡，温度降至-70?C ，将组织投入，若在干冰丙酮中置一盛有异戊烷的容器，组织投入该容器内结冻则更好。 
-上述组织在速冻时应浸埋于OCT包埋剂或甲基纤维素糊状液内，以保护组织。 
-制成冻块后若需保存，应以铝箔或塑料薄膜封包，贮存于-70?C冰箱。  
2、切片 
*供免疫组化用的冰冻切片同样要求附贴平整，并有连续性。 
*载玻片也应清洁无油污，但一般无需涂抹粘附剂； 
*切片时，使用恒温冷冻切片机，在箱内温度-25?C，切片厚度一般为4～8?m 
3、切片后处理 
*切好的冰冻切片，室温下自然晾干1～2h后，放入4?C丙酮固定10min，待干燥后作免疫组化染色或封存于-20℃。
*冰冻切片由于切片技术要求较高，不易得到连续性很好的切片，其形态结构亦不如石蜡片，且冻块和切片不便于长期贮存，因此冰冻切片的应用受限。

(三) 组织印片
*将洁净载玻片轻压于已暴露病灶的新鲜组织切面，细胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。

(四) 细胞培养片(细胞爬片)
*贴壁细胞培养，置盖片于培养瓶中，使细胞在盖片上生长，达适当密度后取出固定(丙酮-20℃固定10～20min)，再进行免疫染色。
-盖片的处理方法同载玻片的处理，但泡酸时间2h即可。 
-为了防止细胞脱片，可用多聚赖氨酸处理。

(五) 细胞涂片
*大多数细胞涂片由细胞悬液制成，包括： 
-血液、尿液、脑脊液； 
-体腔积液； 
-组织穿刺吸取，如骨髓、淋巴结或其他实质性组织 
-悬浮培养的细胞或贴壁细胞经消化后形成的悬液。