真菌毒素检测技术与产品服务（4）

发布时间： 2009/3/27　　点击次数： 2234次

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详细介绍：

液相色谱法对饲料中赭曲霉毒素的测定

摘要：研究了液相色谱法测定饲料原料和配合饲料中赭曲霉毒素的方法。样品经已腈水（84：16）提取，提取液通过赭曲霉毒素净化柱净化、浓缩，C18色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。对添加两个浓度赭曲霉毒素的玉米样品进行添加回收实验，平均回收率为99.12%和103.09%，变异系数RSD分别为0.281%、1.214%，zui低检测限为0.20ng/kg，方法简便易行，准确精密度高，值得推广。

Abstract: HPLC is applied to the determination of ochratoxin A in feed .The sample is extracted with 84/16 acetonitrile/water. Filtrace is cleaned up by ochratoxin purification column. Fluorescent ochratoxin A is separated on NovapakC18 column,and is detected by fluorescent detector and is quantified by external standard. Corn samples are fortified with ochratoxin A at the twe levels. Five replicate analysis are performed each level. The recoveries of ochratoxin A are 99.30%~103.09%.The variation coefficients are 0.281%~1.214%.The detection limit is 0.20ng/kg. The precision and accuracy of this method are satisfactory.

Keywords: HPLC； pretreatment ； ochratoxin A

霉菌遍布世界各地，种类繁多，依生活习性，分为仓储霉菌和田间霉菌，前者指储存原料和饲料在适宜的温度、湿度下产生的霉菌，zui适宜温度为25-30℃，相对湿度80-90%。赭曲霉毒素是温暖地区zui重要的仓储毒素，广泛存在于玉米、大麦、小麦和饲料中,麸皮的污染高于整粒谷物。广东地处亚热带，温湿度十分适宜霉菌的生长，据有关调查该毒素污染在原料和配合饲料中普遍存在，阳性率大于60%²。赭曲霉毒素危害很大，致癌性*。据报道，每千克饲料中含有0.2-0.3克，就可使鸡中毒，zui常见的临床表现有：钙磷吸收障碍，骨骼脆弱，蛋壳钙化不全，破蛋率高，皮下出血，容易挫伤。对家畜主要攻击肾脏、免疫系统和造血系统，肝脏变得脆弱，剧渴，生长迟缓，多尿、下痢、糖尿症。根据中国国家有关规定，赭曲霉毒素的zui高*为：20ug/kg.

现常用的检测方法多为薄层色谱和酶联免疫法，薄层色谱法操作繁琐，污染大、定量差，耗时长，而酶联免疫法虽操作简单，但存在假阳性，准确性欠佳，此液相色谱法操作简便，快速，准确灵敏度高，不失为一种好方法。

1.实验部分：

1.1试剂和仪器

已腈（色谱纯）冰醋酸（分析纯）去离子水

赭曲霉标准液 PuriTox^SR 130赭曲霉毒素净化柱液相色谱仪荧光检测器

1.2步骤

1.2.1 取样：取代表样品5kg，粉碎，充分混合均匀，四分法缩至500g, 因霉菌毒素分布不均匀，充分混合非常重要，必要时取样量加大，有地方建议取15kg。

1.2.2 提取：取25g粉碎样品于250ml三角烧瓶内，加100ml已腈水（84：16），在振荡器上振荡1小时，用定量滤纸过滤。

1.2.3 标准准备：将50ul 10ug/ml 的赭曲霉毒素在一个棕色瓶子里吹干，用10ml的流动相进行溶解，涡旋1分钟，此为50ng/ml的赭曲霉毒素标准液；另将1 ml10ug/ml

的赭曲霉毒素在一棕色瓶子内吹干，用10ml的流动相溶解，涡旋1分钟，此为1ug/ml的赭曲霉加标标准溶液。

1.2.4 净化浓缩：取7ml的样品提取液用PuriTox^SR 130赭曲霉毒素净化柱，然后将净化液转移4ml的净化液到另一试管，60℃水浴中氮气吹干，用400ul的流动相（60/40/1水/已腈/已酸）溶解，涡旋30min ，转移到1.5ml的离心管内10000转离心5分钟，转移350ul 的清洁样品进入液相。

1. 3仪器条件

Waters2695液相色谱仪，2475荧光检测器

色谱柱：NovapakC18（5um） 3.90*150mm Waters PAHC18（5um）4.6*150mm

流动相：60/40 水/已腈

流速：0.5ml/min 运行时间：20min

柱温：40℃

进样体积：60ul

EX:330nm EM:460nm

2.0测定结果

2.1 标准曲线及回归方程：取制定好的50ng/ml的标准溶液，用流动相分别稀释成1、2、5、10、20、30、50ng/ml的浓度，上液相色谱进行检测，根据检测的峰面积对应相应浓度制成标准曲线。相关系数为0.9995，回归方程是Y=1.11×10⁵X-1.85×10³,检测限：0.20ng/kg.

表1. 标准曲线的基本参数：

Tab.1 Regression equation

浓度范围 Concn.Range（ng/ml）	1.0	2.0	5.0	10.0	20.0	30.0	50.0
峰面积 Peak area	103454.993	210799.985	515389.964	1064099.926	2285364.840	3442139..760	5463738.891
相关系数 Correlation	0.9995
回归方程 Regression equation	Y=1.11×10⁵X-1.85×10³
检测限 Limit of detection	0.20ng/kg（按3倍信噪比计算）

2.2不同浓度添加回收实验：取玉米样品1份，分别做两个浓度的添加回收实验，结果见表2。

表2.两个浓度的样品添加回收实验结果表：

Tab.2 Recovery test

组分 Ingtedient	本底值 Known value （ng/ml）	添加标准液的体积	10ul					35ul
赭曲霉毒素	0	添加处理后理论浓度 Added	14.28ng/ml					50.0ng/ml
		添加次数	1	2	3	4	5	1	2	3	4	5
		添加后测得浓度（ng/ml） Found	14.18	14.16	14.13	14.20	14.10	52.06	52.16	51.13	51.68	50.69
		回收率 Recovery （%）	99.30	99.16	98.95	99.44	98.74	104.12	104.32	102.26	103.36	101.38
		平均值 Average value	99.12					103.09
		RSD（%）	0.281					1.214

2.3精密度实验：选择不同含量的玉米样品两份，分别平行测定8次，结果见表3

表3.精密度实验结果

Tab.3 Precision test

检测次数	1	2	3	4	5	6	7	8	平均值	RSD
样品1测定值 Sample 1 Found（ng/ml）	11.23	11.46	11.41	11.36	11.87	11.97	11.67	11.75	11.59	2.27
样品2测定值 Sample 2 Found（ng/ml）	28.57	28.62	28.68	28.98	28.87	28.12	28.92	28.53	28.66	0.963

3.0结论：

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