ELISA克隆试剂盒

ELISA克隆试剂盒

1 原理：
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。
ELISA 常用的酶和底物
辣根过氧化物酶，底物为OPD, 深桔 ，检测波长492nm
TMB，蓝绿色，检测波长450nm
碱性磷酸酶，底物为PNPP（对－消基苯磷酸酯）,
检测波长405nm
ELISA各步骤的反应时间
包被：24－36h，蛋白浓度为1－5ug/ml
封闭：37ºC 2h 或4ºC过夜（3％BSA）
样本反应时间：37ºC 45min-1h
酶标抗体反应时间： 37ºC 45min-1h
显色时间：15min（避光）
设对照
可以一次包被多块板，冻存备用
2 类型
（1）间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。
常用于临床血清中自身抗体的检测，以及杂交瘤上清特异性抗体的筛选。如血清中PDCD5自身抗体的检测。

（2） 双抗体夹心法测抗原
是检测抗原zui常用的方法。
只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。
常用的组合：单克隆抗体＋多克隆抗体
单克隆抗体＋单克隆抗体
后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。
用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。

双抗体夹心法测抗原的方法：
捕获抗体包被→封闭（3％BSA）→待测抗原→洗涤（含0.1％Tween的PBS）→酶标单抗或多抗→洗涤→显色→检测
（3）竞争法测抗原
1）抗体固相测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。
其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，zui后的显色也愈浅。
方法：抗体包被→封闭→同时加入待测抗原和酶标抗原→洗涤→酶底物→显色→ELISA reader检测
2）抗原固相测抗原
其原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，zui后的显色也愈浅。
方法:
a: 抗原包被96孔板； b:封闭;
c: 待测抗原与抗体反应一定时间； d: 加入96孔板
e: 洗涤 f：加入酶标二抗
g：洗涤 h：显色和检测

（4）IgM抗体的检测
1）间接法：
间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定血清中的IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部分IgM抗体不能结合到固相上，将出现假阴性结果。 因此，如果用抗IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。
方法：
a: 抗原包被96孔酶标板； b:封闭;
c: 待测血清与A蛋白反应一定时间后离心
d: 吸取上清液加入96孔酶标板
e: 洗涤 f：加入酶标抗IgM的抗体
g：洗涤 h：显色和检测
2）捕获包被法（夹心法）
先用抗人IgM抗体包被ELISA板，以捕获血清标本中的IgM（包括针对抗原特异性的IgM和非特异性的IgM）。然后加入相应抗原，继而加入针对抗原特异的酶标抗体，再与底物作用，颜色的深浅即与标本中的IgM含量成正相关。
方法：
a: 抗人IgM抗体包被96孔酶标板； b:封闭;
c: 加入待测血清； d: 洗涤96孔酶标板
e: 加入相应抗原 f：加入抗原特异的酶标抗体
g：洗涤 h：显色和检测
（5） ABS-ELISA技术 （Avidin Biotin system-ELISA
原理
亲和素是一种分子量是60，000的碱性蛋白，由四个相同亚基组成，每个亚基有一个生物素分子结合点。两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种材料所标记，成为一种生物反应放大系统。生物素化抗体可捕获多个亲和素，后者再与酶结合，加入底物后，产生颜色反应。这一系统可以大大提高ELISA的灵敏度。
操作过程：
抗原包被→封闭→待检标本→生物素化抗体→洗涤→ 酶标记亲和素→洗涤→加底物显色和检测