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大鼠 (Rat) Toll样受体-4 (TLR-4)ELISA试剂盒

发布时间： 2023/2/6　　点击次数： 564次

提供商：	研域（上海）化学试剂有限公司	资料大小：
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资料类型：	DOC	浏览次数：	564 次
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试验原理：

TLR-4试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知TLR-4浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将TLR-4和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中TLR-4的浓度呈比例关系。

试剂盒内容及其配制 :

试剂盒成份（2-8℃保存）	96孔配置	48孔配置	配制
96/48人份酶标板	1块板（96T）	半块板（48T）	即用型
塑料膜板盖	1块	半块	即用型
标准品：8.0ng/ml	1瓶（0.6ml）	1瓶（0.3ml）	按说明书进行稀稀
空白对照	1瓶（1.0ml）	1瓶（0.5ml）	即用型
标准品稀释缓冲液	1瓶（4.0ml）	1瓶（2.0ml）	即用型
生物素标记的抗TLR-4抗体	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
亲和链酶素-HRP	1瓶（8.0ml）	1瓶（4.0ml）	即用型
洗涤缓冲液	1瓶（20ml）	1瓶（10ml）	按说明书进行稀释
底物A	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
底物B	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
终止液	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
标本稀释液	1瓶（12ml）	1瓶（6.0ml）	即用型

大鼠 (Rat) Toll样受体-4 (TLR-4)ELISA试剂盒自备材料 :

1．蒸馏水。

2．加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3．振荡器及磁力搅拌器等。

安全性 :

1．避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。

2．实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。

3．不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。

操作注意事项 :

1．试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

2．实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

3．不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

4．使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

5．使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

6．洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

7．底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

8．加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

9．按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

样品收集、处理及保存方法 :

1、血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2、血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。

3、细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4、组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液

5、保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

试剂的准备 :

1．标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行：

8.0 ng/ml	（6号标准品）	原倍浓度不用稀释直接加入50ul。
4.0 ng/ml	（5号标准品）	100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
2.0 ng/ml	（4号标准品）	100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
1.0 ng/ml	（3号标准品）	100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
0.5 ng/ml	（2号标准品）	100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
0.25ng/ml	（1号标准品）	100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
0 ng/ml	（空白对照）	原始浓度不用稀释直接加入50ul。

2．洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。

大鼠 (Rat) Toll样受体-4 (TLR-4)ELISA试剂盒操作步骤 :

1．使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。

2．根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。

3．加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。

4．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

5．每孔加入60ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

6．甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。

8．取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。

9．在450nm波长处测定各孔的OD值。

建议使用的实验方案 :

标准品浓度（ng/ml）

8.0

样品

4.0

样品

2.0

样品

1.0

样品

0.5

样品

0.25

样品

局限 :

6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。

试剂盒性能 :

1. 灵敏度：小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。

2. 特异性：不与其它细胞因子反应。

3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。

结果判断与分析 :

1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值

2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的TLR-4标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的TLR-4含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。

3、检测值范围：0-8.0ng/ml

4、敏感度： 0.01 ng/ml

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