利用Ion半导体测序开展基因表达谱分析

             研究显示杂交芯片可产生大约两百万个已定位的读取[7]，但也有研究证实，即使读取数目过亿，提高读取数目仍然继续增加其信息量 那么，究竟Ion PGM™测序仪生成多少个100 base读取能相当于一个基因表达微阵列芯片呢？在白皮书[9]中我们对Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays （HG-U133 Plus 2.0）的芯片质量控制（MAQC）的微阵列数据与Ion PGM™系统生成的RNA-Seq数据进行了比较。图1显示了Ion PGM™测序仪数据按照不同检测阈值下所得的基因数和微阵列芯片所能检测到的基因数。当采用zui严谨的检测阈值即每个基因≥10读取时，两百万个来自Ion PGM™测序仪的已定位读取所能检测到的基因数超过了微阵列芯片能检测的基因。

             当读取计数阈值放宽到≥5读段数/基因时，仅仅1百万个Ion RNA-Seq已定位读取所能检测到的基因数就超过了芯片的基因检测数。利用来自Ion PGM™测序仪的2百万个平均读取所能检测到的显著差异表达基因数（sig DEGs）要多于微阵列芯片所能检测到的sig DEGs数。在p ≤0.05和倍数变化f≥2标准下，在HBRR和UHRR样本中Ion PGM™测序仪得到的sig DEGs数为4,630，而相比之下芯片得到的sig DEGs数为4,198将Ion PGM™测序仪生成的两百万个已定位读取所产生的基因差异表达结果与qPCR结果相比较，发现qPCR 和RNA-Seq得到的sigDEGs倍数变化的对数值的Pearson相关系数（R）超过0.95。

             在Ion PGM™平台进行RNA-Seq实验的另一个优势在于，能够应用ERCC RNA Spike-In Mix对转录本检测灵敏度进行评估。这些ERCC转录本混合物是一些含多聚腺苷酸化且无标记的RNA，该混合物经过美国国家标准技术研究所（NIST）鉴定，是评估RNA测量系统性能的工具，能控制实验可变因素。这些ERCC转录本的GC含量经过平衡，更贴近真核生物内源性mRNA的特征，它们的长度范围在250 到2,000个核苷酸之间。ERCC转录本混合物的含量构成经特殊设计，能代表一个大动态范围的表达水平。ERCC ExFold RNA Spike-In Mix可用于评估基因差异表达的检测灵敏度。这些质控RNA使用户得以直接评估文库质量、检测灵敏度、动态范围以及表达倍数变化。剂量响应散点图显示，ERCC相对浓度的对数值与已定位读取数的对数值呈线性关系（图2）。利用这些外部RNA质控有助于将来自合作实验室所产生的结果进行直接比较。