间接ELISA检测鸭瘟病毒

间接ELISA检测鸭瘟病毒
①包被抗原的制备。取种毒适量，按2000u／ml加入双抗，接种12日龄番鸭胚，接种量o，2ml／个，放人温箱内孵化，逐日照胚，连续培养5天，收集接种后48—120h内死亡，胚体有典型病变的鸭胚尿囊液，8000r／min离心20min，取上清液，加入等量饱和硫酸铵，使其终浓度达50％饱和度，用玻棒搅拌均匀，置4℃过夜。次日把溶液混匀，10000r／min4℃离心30rain，沉淀用StolpH 7，4 PBS溶解，装入透析袋内，用PBS透析。磁力搅拌器搅拌90min后置4℃过夜，期间换液4次。用10％BaCl2检测透析液中有无SO42-，直至检测不出SO42-为止。病毒液一20~C冻存备用。用常规方法处理SephadexG—200装柱，取硫酸铵粗提的病毒样品加在柱床上面，待病毒液全部进入柱床后用PBS洗脱，控制流速o．5mi／113．111，收集20管，每管5ml，722分光光度计测定各管的OD280和OD260值，依据公式蛋白浓度（mg／rnl）＝1．45 OD280一0．74OD260。计算各管的蛋白浓度，以蛋白浓度为纵坐标，试管号为横坐标，绘制洗脱曲线，并计算每管的OD280／OD260，把比值大于1的各试管合并，用60％PEG-6000浓缩后再测定其蛋白浓度，作为包被抗原。
间接ELISA检测鸭瘟病毒
②间接ELISA*反应条件的选择。
酶标抗体*工作浓度测定 参照文献的方法提取健康鸭血清IgG，透析除盐，再经SephadexG—25柱进一步除盐，共收集lo管，于280nm波长处测各管的OD值，绘制洗脱峰曲线，取蛋白吸收峰高的几管合并，分光光度计测其蛋白浓度。以o．05mol／LpH 9．6碳酸盐缓冲液将鸭IgG稀释至100bg／mi，于酶标板的每孔中加入100／~L，置湿盒中4~C过夜。取出反应板，洗液（PBS—T，含0．05％tween 20的PBS洗涤3～5遍，拍干。加封闭液（含0．5％BSA的PBS-T），100iLL／孔，室温作用2L，洗涤3—5遍，拍干。以稀释液（含0，1％BSA的PBS-T）将酶标抗体作1：100、l：200、1：400、l；800等一系列稀释，依次加入各小孔中，每个稀释度加两孔，每孔100t~L，室温作用5h，洗涤。加底物溶液（OPI~Hz02，室温避光20min，加入2mol／L H2SO：终止反应，50t~L／{L。490nm波长下测OD值，以能产生光密度为1．o的稀释度为酶标抗体的zui适浓度。间接ELISA检测鸭瘟病毒
抗原和血清*稀释度的选择 采用方阵滴定法确定抗原和血清的*工作浓度用0．05mol／LpH 9．6碳酸盐缓冲液将抗原作1：10、1；20、1：40、1：80、l：160、1：320稀释，分别加入到酶标板的第1列至第12列，每个稀释度加两孔，每孔100／mL，37~C作用1h，转入4~C过夜；次日洗涤后封闭，再洗涤；用含o．1％BSA的PBS—T将阴、阳血清作1：20、㈠40、1：80、1：60稀释，阳性血清的4个稀释度依次加入到酶标板的1行、3行、5行、7行，阴性血清的4个稀释度依次加入到酶标板的2行、4行、6行、8行，每孔1001LL，置湿盒内37~C作用1h，再洗涤；加人1：400工作浓度的酶标抗体，37℃1h，洗涤；加底物溶液，室温闭光30min；加终止液，490nm测其OD值。以尸／Nzui大者所对应的抗原和血清稀释度作为抗原*包被浓度和血清*工作浓度。
ELISA反应温度和间隔时间的选择 a，抗原吸附时间和温度：抗原包被后分别以37~C 1h转入4~C过夜和直接37~C 5h吸附，对8份血清进行间接ELISA检测，测定OD值。b．封闭液封闭时间和温度、血清反应时间和温度、酶标抗体工作时间和温度的确定均选择37~C 1h，37~C 2h、室温2h三种条件，对4份效价较高的血清样品进行ELISA检测，比较它们的OD值差异。c底物zui适作用时间的确定：以zui适稀释度抗原、血清和酶标抗体进行试验，加入底物后分别在室温10min、20min、30rain终止反应，比较其OD值差异。阴阳性血清临界值的确定 采集从1日龄饲养至28天，未作任何疫苗免疫的健康鸭血清30份，分别与等量鸭胚液混合，室温作用2L，高速离心，取上清液作为阴性血清。测定30份血清的OD值，以OD平均值加上3个标准差作为判定临界值，受检血清高于此值即判为阳性。

③间接EIASA操作程序a．以zui适浓度的抗原包被反应板，100rtl／孔，37~C 1h转人4~C过夜，次日洗板3—5次，每次5min，拍干。b．以含O．5％BSA的PBS—T封闭，37~Clh，洗板3—5次。c．加入zui适稀释度的待检血清，37~C 1h，洗板。d．加入zui适工作浓度的酶标抗体，37~C 1h，洗板。e．加入底物，室温避光30min。f．加入终止液，50ul/孔 g．490nm波长下测OD值。