口蹄疫酶联免疫吸附试验（ELISA）

口蹄疫酶联免疫吸附试验（ELISA）

1979年Crowther建立了间接夹心ELISA，ELISA试验是当前应用zui广的一种免疫测定方法，它是以物理方法将抗体（或抗原）吸附在固相载体上，随后的一系列免疫学反应和生物化学反应都在此固相载体上进行的免疫酶测定试验，包括间接法、双抗体夹心法和竞争法以及近年来发展的一些改良法。1989年被欧洲FMD防制委员会推荐广泛使用，成为认可的一种标准化诊断技术。

近年来，ELISA已先后用于FMD病原和血清样品的诊断并逐步代替补体结合试验以及中和试验。这项技术快速、敏感、准确，用灭活的140S制备抗血清或作抗原，可在一般的实验室操作，还可制成方便的诊断试剂盒。检测田间样品时ELISA的敏感性高于补体结合试验；对于含量较高的样品，例如新鲜的水疱皮和细胞培养物，可在2—4h内获得结果，应用预先在实验室内包被的免疫反应板以及冻干剂，将更便于现场检测。

2004年G．丸Paiba等应用固相竞争ELISA（SPCE）对绵羊、山羊和猪分别进行了O型FMD血清学抗体检测，并对效果进行了比较。试验对2001年英国暴发FMD其间的267头绵羊和143头猪分别进行VNT和SPCE检测，发现SPCE较VNT能够检测出更多的阳性结果。2001年英国FMD暴发期间大规模的血清学调查已充分证实了SPCE方法的灵敏性、可施行性和可重复性。同时田间血清学试验和实验室血清学实验也同样表明与VNT相比，SPCE方法的敏感性很少因病毒毒株的不同而受影响。

以ELISA为基础的检测方法，有许多客观的优越性，敏感性相对较高且适合于大规模的血清学调查，FMDV非结构蛋白特异性抗体会存在于FMDV持续感染、短期感染、间歇性感染的猪体，因此FMDV非结构蛋抗体检测试剂盒已经被研制。我国中国台湾省已经开始使用NSP抗体检测ELISA试剂盒。ELISA同时也存在着弊端，2004年Fan Lee等对三种FMDV非结构蛋抗体检测试剂盒（CHEKIT FMD—3ABC、UBI FMD NS EIA和DVIVRNSPELISA）检测效果进行了对比研究。这些FMDV非结构蛋白抗体检测试剂盒被分别应用于健康猪、感染猪和疫苗免疫过的猪，并对试剂盒的特异性与灵敏度进行了检测。表明特定的三种FMDV非结构蛋白抗体检测试剂盒都很难将感染病畜与已康复牲畜区分开，这给检测工作带来了较大的困难。

①间接夹心ELISA。间接夹心ELISA是目前OIE FAO（联合国粮农组织）的FMD—WRI。（世界参考实验室）确认的检测FMDV抗原和病毒血清型的方法。该法采用典型的双抗夹心ELISA操作方式，在ELISA多孔板的不同排部分用型特异兔抗FMD病毒几个血清型的抗血清（捕获抗体）包被，于各孔加入被检样品悬液，并设强阳性、弱阳性、阴性和空白对照，再加每个FMDV型特异的豚鼠抗血清（检测抗体），随后，加酶标记的羊抗豚鼠血清（交联剂）。每一步都应充分洗涤未结合的试剂。加酶底物后，出现颜色反应时可判为阳性反应，强阳性反应时，肉眼即可判定。也可用酶标读板仪在适当的波长内读取结果，在这种情况下，光吸收值比背景大o．1以上即可判为阳性反应，可定出相应的血清型。光吸收值接近o．1时，应重复做或用组织培养物传代扩增抗原，当出现CPE时，检测上清液。间接夹心ELISA用于FMD的检测和定型时，特异性与CFT相同，灵敏度更高，且节省试剂，重复性好，加之与连接计算机的酶标仪可使操作自动化，判读结果更准确，在接到待检样品后4～5h即可出结果。对于FMD的检测和定型及制定FMD的防治计划，有着十分重要的意义。

②液相阻断夹心ELISA。1986年Hamblin等的液相封闭ELISA（LPBE）问世，该法是将各型已知量的病毒与2倍连续稀释的被检血清混合37~C振荡lh后转入4~C湿盒作用，使之充分结合。待检血清中若含有某型抗体，必然与同型病毒抗原结合。试验时将上述混合液转入已用各型相应捕获抗体包被好的ELISA板中，之后依次加入检测抗体、交联剂、底物和终止液，zui后用酶标仪判读结果。若有未结合的抗原，必然会与捕获抗体结合。形成的复合物与随后的检测抗体作用，zui后按试验孔呈现颜色与抗原对照（末加血清）孔呈现的颜色相比判定结果。颜色的深浅和抗体的含量呈负相关，即颜色越深，被检血清中的抗体含量越少。当被检样品的OD（光学密度）值小于或等于对照抗原OD值的50％时，该样品判定为阳性，血清抗体效价以产生相当于50％抗原对照平均值的血清zui终稀释度表示。其抗体效价1；40相当于VNT效价1：16（VNT检测标准是抗体效价在1：16以下为阴性）。该方法尤其适合于大批样品的血清学调查。弥补了VNT的不足，由于VNT方法易产生假阳性反应，需要有一定的技能来产生重复性的结果，因此ELISA方法已经被*大量的实验室采纳作为疫病监测方法。对于FMD血清抗体的监测具有广阔的应用前景。