ELISA试剂盒的应用与操作步骤

ELISA试剂盒的应用：

　　1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。

　　2、研究抗酶抗体的合成。

　　3、显现微量的免疫沉淀反应。

　　4、定量检测体液中抗原或抗体成份。

ELISA试剂盒的操作步骤：

　　一、双抗体夹心法

　　1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃ 。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。

　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃ 孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小时，洗涤。

　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。

　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

　　二、间接法

　　1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃;

　　2.次日洗涤3次;

　　3.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤;

　　4.（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml;

　　5.37℃孵育35-60分钟，洗涤;

　　6.’zui后一遍用DDW洗涤。

　　其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

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