细胞冻存方法

细胞冻存的一般方法 
 
开始细胞冻存前，仔细检查细胞冻存所需的仪器和试剂是否齐全：一般主要有：传代细胞单层、适宜生长液、灭活小牛血清、庆大霉素溶液、7.5％NaHC03溶液、0.25％胰蛋白酶溶液、标签用具：100ml方瓶（培养细胞用）、克氏瓶、红翻帽塞、吸管（10ml、lml）、细胞冻存管、二甲基亚砜、CO2孵箱、超挣台、倒置显微镜、2～8℃冰箱、-20℃冰箱、液氮罐

操作步骤

镜检细胞，挑选培养3～4天的细胞，生长状态良好，无污染、异常及可疑病变细胞。配制细胞培养液：根据不同的细胞需用不同的基础液，培养液配方为（基础液：7.5%碳酸氢钠：1万单位庆大霉素=100：1：0.25）。制备细胞悬液：挑选培养3—4天的细胞，细胞界限清晰，具有立体感，细胞形态良好的单层细胞瓶，弃去培养液，先用PBS洗液冲洗细胞表面1-2次，再向克氏瓶中加入0.25%胰酶8ml，等细胞面开始出现裂缝时倒掉瓶中部分胰酶，大克氏瓶中保留2 ml，放置几分钟使细胞*脱落到胰酶中，收集含细胞的胰酶，并用培养液冲洗细胞瓶3-4次，收集冲洗液；向收集液中补加以下物质：小牛血清使终浓度为20%、二甲基亚砜使终浓度为9%；分装：将细胞悬液混匀后，立即分装于细胞冻存管中，每管按1～1.6ml的量分装，拧紧管盖；在冻存管上做好标记，包括细胞代号及冻存日期等。

冻存

先将冻存管放入普通冰箱冷藏室（2～8℃），约3-4h；接着将冻存管置于普通冰箱冷冻室，约3-4 h；然后将冻存管放置液氮灌口，过夜；zui后将冻存管投入液氮保存。记录：记录内容包括冻存日期、细胞代号、冻存管数、冻存过程中降温的情况、冻存位置以及操作人员。




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